Karbohidrat atau sakarida merupakan molekul organik paling banyak yang ditemukan di alam. Komponen ini terdiri dari monosakarida (seperti glukosa, fruktosa, xylosa, dan manosa), disakarida (seperti sukrosa, laktosa, dan maltose), trisakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Karbohidrat juga merupakan salah satu zat gizi makro -selain protein dan lemak, yang berkontribusi dalam memenuhi kebutuhan energi tubuh. Untuk menggunakannya sebagai sumber energi, manusia terlebih dahulu mencerna karbohidrat, baik yang berasal dari asupan makanan ataupun cadangan dalam tubuh.
Polisakarida kompleks contohnya adalah dinding sel bakteri dan tanaman, termasuk juga cadangan karbohidrat tanaman yang digunakan sebagai sumber energi. Selain itu ada juga gula ribosa dan deoxyribosa yang menyusun RNA dan DNA. Karena luas dan pentingnya peranan karbohidrat, keberadaannya sangat menarik perhatian berbagai bidang, mulai biologi, lingkungan, klinis, hingga medis. Pengawasan mutu bahan pangan untuk menjamin pasokan karbohidrat berkualitas juga telah tersedia bagi konsumen.
Teknik analisa yang umum digunakan untuk menentukan karbohidrat adalah ‘H-nuclear magnetic resonance (NMR), fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), serta gas and liquid chromatography yang diikuti dengan mass spectrometry (MS). Metode spectroscopic membutuhkan investasi biaya peralatan yang tinggi dan operator yang handal. Sementara itu gas chromatographic membutuhkan waktu derivasi yang panjang.
Berdasarkan alasan tersebut, high performance anion exchange chromatography semakin banyak digunakan untuk analisa karbohidrat. Dalam fase gerak basa, anion gula dipisahkan dalam resin penukar anion. Walaupun demikian, deteksi karbohidrat secara langsung dan sensitif tetap menjadi tantangan tersendiri. Detektor ultraviolet dan flouroscence tidak dapat digunakan, karena kurangnya kemampuan chromophore dan fluorophore, serta deteksi indeks refraktif yang kurang sensitif. Sementara itu elusi gradient tidak dapat digunakan. Selama beberapa tahun, reaksi derivatisasi post-column direkomendasikan untuk deteksi karbohidrat dengan metode spectrophotometric. Namun, sensitvitas metode tersebut sangat dipengaruhi oleh teknisi dan sering terjadi kesalahan prosedur.
Karbohidrat adalah senyawa aktif elektrokimia, oleh sebab itu deteksi amperometrik dapat digunakan untuk mengatasi masalah tersebut. Tiga tahapan gelombang sebagai pulsed amperometric detection(PAD) dapat digunakan. Pertama, positive potential (E1) digunakan untuk menentukan analit target. Kemudian diikuti oleh tahap kedua, positive potential (E2) untuk menghilangkan proses oksidatif reaksi produk dari permukaan elektroda. Ketiga adalah negative potential (E3) yang berfungsi mengurangi oksida pada permukaan elektroda. Secara keseluruhan tiga tahapan proses tersebut membutuhkan waktu kurang dari satu detik, dan mengalami pengulangan tiap detiknya untuk mencegah kesalahan elektroda.
Selain karbohidrat, PAD juga telah terbukti mampu menganalisa gula amino, asam amino, amina biogenic, bahan yang mengandung sulfur, alkohol, dan beberapa antibiotik.
Potensi penggunaan kromatografi ion yang dikombinasikan dengan pulsed amperometric detection pada sampel pangan dapat dilihat sebagai berikut:
Bahan dan alat
a. Bahan
Chromatographic equipment:
• 871 Advanced Bioscan
• 838 Advanced IC Sample Processor
• 833 Advanced IC Liquid Handling Pump Unit
• 833 Advanced IC Liquid Handling Dialysis Unit
• 818 Advanced IC Pump.
Kontrol peralatan,pengumpulan data, dan pengolahan dilakukan menggunakan Metrodata IC Net software (Metrohm AG).
b. Reagent dan eluents
Karbohidrat dengan grade reagen dari Fluka (Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland). Semua larutan standar dan eluents dipersiapkan menggunakan air deionisasi dengan specific resistance lebih tinggi dari 18 MΩ•cm.
Contoh 1. Pengujian karbohidrat pada malt extract
Baik malt extract kering ataupun cair, keduanya berasal dari germinasi barley dan secara alami mengandung enzim, khususnya amilase, yang mengubah karbohidrat menjadi gula. Malt extract mamiliki nilai gizi dan fisiologi yang tinggi. Sehingga sering digunakan sebagai suplemen diet bayi dan orang tua. Lebih lanjut, malt merupakan ingridien penting untuk makanan bayi, roti, kopi instan, minuman, farmasi, dan lainnya.
Prosedur pengujian
Penyiapan sampel malt extract berupa pengenceran 1:100. Kemudian diinjeksi secara langsung.
Hasil
Glukosa, fruktosa, dan sukrosa merupakan komponen utama yang bertanggung jawab terhadap rasa manis dalam bahan pangan. Selain itu, terdapat dua jenis gula yang memiliki konsentrasi sangat kecil sehingga tidak terdeteksi (Gambar 1). Selain glukosa dan maltosa, juga terdapat beberapa maltooligosakarida. Sakarida yang teredeteksi menunjukkan komposisi malt secara umum.
Contoh 2 – Kadar karbohidrat pada produk susu
Analisa sampel yang mengandung protein seperti produk susu dapat menyebabkan permasalahan jika diinjeksi secara langsung. Presipitasi protein mengotori kolom dan merusak sampel. Hal ini bisa dicegah dengan mengintegrasi prosedur presipitasi upstream seperti Carrez presipitasi. Bagaimanapun, terlepas dari persiapan intensif tenaga kerja, presipitasi Carrez mengalami inklusi copresipitasi dan dekomposisi gula. Sebaliknya, pemisahan karbohidrat dari protein bermolekul tinggi dapat dicapai melalui dialysis stopped-flow. Teknik ini berdasarkan pada selective diffusion molekul atau ion dari larutan satu ke larutan yang lain (dari larutan donor/sample ke larutan akseptor) melalui membran.
Perpindahan diakibatkan perbedaan gradien yang melewati membran. Pemisahan ambang batas molekul secara umum ditentukan oleh ketipisan dan porositas membran. Tidak seperti pada dialisis dinamis, di mana dua larutan secara kontinyu melewati modul dialisis, dalam kondisi setimbang, setidaknya satu larutan akan berhenti sementara hingga dicapai konsentrasi akseptor yang sama dengan konsentrasi donor. Prosedur ini setidaknya akan menghabiskan waktu 14 menit dan secara langsung diproses dalam sebuah IC (Gambar 3).
Pengujian
Kadar karbohidrat pada yoghurt buah dapat ditentukan menggunakan prosedur berikut :
Sebelum dialisis, 10 g yoghurt dilarutkan dalam 1 liter air ultrapure dan larutan diencerkan 1:10 (v/v). 10 mL dari larutan ini dilewatkan ke membrane dialysis menggunakan pompa peristaltik dalam 838 Advanced IC Sample Processor, sementara larutan akseptor didiamkan. Karbohidrat yang dapat didialisis tersebut bermigrasi dari arus sampel ke larutan akseptor, konstituen protein dengan molekul tinggi tetap pada sisi sampel di membran. Dan diakhiri dengan larutan akseptor ditransfer ke putaran sampel.
Hasil
Gambar 4 menunjukkan kromatogram dari yoghurt buah dialisat dengan puncak-puncak: polyol inositol, sugar alcohol sorbitol dan mono- dan disaccharides glucose, galactose, fructose, lactose dan sucrose.
Pengulangan analisa menunjukkan tidak ada tren pada luas dan tinggi puncak maupun waktu retensi, yang menunjukkan sampel protein tidak melewati membran. Sebaliknya, recovery rates karbohidrat ada diantara 95-105% mengindikasikan kuantitatif permeabilitas dari membrane untuk karbohidrat target dan aplikasi dari teknik dialisis.
Ikhtisar kandungan karbohidrat pada berbagai produk pangan
Analisa karbohidrat menawarkan kemungkinan aplikasi dengan jangkauan luas untuk analisa produk pangan (lihat Tabel 1). Tidak seperti matriks protein yang sudah disebutkan, sebagian besar sampel bahan pangan hanya membutuhkan metode persiapan sampel seperti comminution, dilution, extraction, sonication dan atau filtration.
Preparasi sample juga dimungkinkan untuk menganalisa karbohidrat pada ekstrak tanaman,Tabel 1 menyajikan penentuan berbagai poliol, gula alcohol baik mono-, di- dan oligosakarida pada berbagai bahan pangan.darah, urine, produk farmasi, bahan peledak maupun biofuels.
Kesimpulan
Kromatografi High-performance anion-exchange dengan pulsed amperometric detection menggunakan elektroda emas dapat digunakan untuk menentukan berbagai karbohidrat pada beragam matriks pangan.
Di mana kebanyakan sampel tidak membutuhkan persiapan lainnya selain ekstraksi, comminution, pelarutan ataupun filtrasi; penentuan karbohidrat pada matriks yang sulit dapat diselesaikan dengan mudah menggunakan Teknik Dialisis Metrohm.
Referensi
• T.R.I. Cataldi, M. Angelotti and G. Bianco, Anal. Chem., 485, 43–49 (2003).
• A. Meyer, C. Raba and K. Fischer, Anal. Chem., 73, 2377–2382 (2001).
• P. Deepak, Food&Pack, 40 (2002).
• M.M. Takematsu et al., Quantification of carbohydrates and uronic acids in eucalyptus wood species by ion chromatography with PAD using a gold electrode, Pittcon 2008, http://products.metrohm.com (search for 8.000.6018EN).
• Metrohm International Headquarters
Oberdorfstrasse 68, CH-9101 Herisau, Switzerland
tel. +41 71 353 85 04
E-mail: aw@metrohm.com
Website: www.metrohm.com
Oleh : Alfred Steinbach and Andrea Wille, Metrohm AG, Herisau, Switzerland.
(FOODREVIEW INDONESIA Edisi Januari 2011)
