Pendugaan Pertumbuhan dan Inaktivasi Mikroba pada Pangan

Pangan mengandung nutrisi yang diperlukan oleh mikroba untuk tumbuh dan berkembang hingga pada tingkat yang dapat memberikan keuntungan, menyebabkan kerusakan, atau menyebabkan penyakit pada manusia.

Pertumbuhan mikroba pada pangan tersebut dipengaruhi antara lain oleh faktor intrinsik, seperti pH, kadar garam, konsentrasi pengawet yang digunakan, maupun faktor ekstrinsik seperti temperature.

Untuk mengetahui apakah desain suatu produk atau perlakuan yang diterapkan dapat mendukung pertumbuhan atau inaktivasi suatu mikroba, seseorang dapat melakukan uji tantangan atau challenge test, yang melibatkan pengujian dengan menggunakan mikroba target atau pengganti (surrogate). Namun demikian, uji tantangan tersebut memerlukan keahlian, waktu, dan biaya yang besar, sehingga tidak dapat diakses dengan mudah oleh seluruh pelaku yang membutuhkan.

Pemodelan prediktif dengan menggunakan model/persamaan matematika dapat digunakan sebagai alternatif untuk menduga apakah suatu produk pangan dan/atau perlakuan yang diterapkan dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan atau mengeliminasi suatu mikroba hingga tingkat yang aman. Dalam penggunaannya, pemodelan prediktif tersebut memerlukan input data kinetik pertumbuhan atau inaktivasi, berupa data sekunder. Data primer merupakan data yang dikumpulkan melalui percobaan di laboratorium maupun data internal yang dimiliki perusahaan, sementara data sekunder dikumpulkan dari literatur terkait produk dan kondisi yang akan dimodelkan.

Pendugaan pertumbuhan mikroba
Dalam menduga pertumbuhan suatu mikroba dikenal beberapa model yang dapat dimanfaatkan, baik oleh peneliti, praktisi maupun industri, berupa model primer, model sekunder dan model tersier. Model pertumbuhan primer digunakan untuk menduga jumlah mikroba berdasarkan fungsi waktu. Model primer yang sering digunakan untuk menduga pertumbuhan mikroba pada suatu matriks atau media antara lain model linier, logistik, Gompertz, Baranyi, maupun modifikasi dari modelmodel tersebut. Selanjutnya, bagaimana model-model primer tersebut dapat dimanfaatkan dan data apa saja yang diperlukan untuk menduga pertumbuhan suatu mikroba pada pangan?

Salah satu model primer yang dapat digunakan adalah model logistik pada persamaan [1] (Rosso et al., 1996), yang memiliki 4 (empat) parameter kinetika pertumbuhan, yaitu Nmax atau jumlah mikroba maksimal sesuai kapasitas nutrisi suatu media (dapat diasumsikan sebesar 108 – 109 CFU/ ml(g)) atau 8 – 9 log10 CFU/ml(g), N0 atau jumlah kontaminasi awal (dapat diasumsikan berdasarkan informasi dari literatur maupun data internal yang dikumpulkan/dimiliki), μmax atau laju pertumbuhan maksimal yang spesifik terhadap suatu kondisi tertentu, dan lag atau waktu yang diperlukan suatu mikroba untuk beradaptasi pada suatu lingkungan atau media yang baru. Pendugaan pertumbuhan sering dilakukan tanpa menggunakan fase lag (persamaan [2]) dengan pertimbangan keamanan, karena setelah melewati fase ini mikroba dapat tumbuh pada pangan hingga tingkat maksimal sesui dengan kapasitas media dan kondisi lingkungan yang digunakan. Laju pertumbuhan maksimal dapat diperoleh dari literatur, atau diduga dari data internal yang dimiliki oleh suatu industri/institusi. Sementara Nt adalah jumlah mikroba pada waktu t, yang diperoleh dari pengujian atau berdasarkan data yang dipublikasikan dalam literatur.



Sebagai contoh suatu industri/ institusi memiliki data jumlah sel Listeria monocytogenes pada susu yang disimpan selama 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 dan 20 hari pada suhu 7°C sebagai berikut: 2,08; 2,99; 4,08; 4,95; 5,92; 7,01; 7,83; 8,15; 8,35; 8,37; 8,32 log CFU/ml. Industri/institusi ini ingin menggunakan data tersebut untuk menduga pertumbuhan L. monocytogenes pada media dan kondisi penyimpanan yang sama. Untuk itu, model primer akan digunakan untuk menduga laju pertumbuhan maksimal L. monocytogenes pada susu yang disimpan pada suhu 7°C. Pendugaan tersebut dapat dilakukan dengan bantuan perangkat lunak/software seperti MATLAB, RStudio, Tablecurve, atau menggunakan fungsi solver add in yang dimiliki oleh Microsoft Excel. Pendugaan dilakukan melalui penyesuaian model dengan data yang dimiliki (model fitting) menggunakan salah satu software di atas, sehingga diperoleh hasil pendugaan laju pertumbuhan maksimal L. monocytogenes pada susu yang disimpan pada suhu 7°C berdasarkan data di atas sebesar 1.13/hari (Gambar 1).

Laju pertumbuhan sebesar 1,13/hari tersebut selanjutnya dapat digunakan untuk menduga pertumbuhan L. monocytogenes, sehingga seseorang tidak perlu melakukan pengujian setiap saat untuk mengetahui pertumbuhan L. monocytogenes pada media dan kondisi yang sama. Pendugaan dilakukan dengan memasukkan parameter kinetika pertumbuhan, yaitu laju pertumbuhan maksimum dan parameter lain yang relevan (No dan Nt) pada model primer. Untuk memastikan akurasi pendugaan, seseorang perlu melakukan validasi melalui uji laboratorium atau menggunakan data literatur dengan media dan kondisi yang sama. Data baru yang diperoleh dari laboratorium atau literatur selanjutnya dibandingkan dengan hasil pendugaan. Akurasi pendugaan menggunakan model primer tersebut umumnya dinilai secara statistik melalui uji faktor bias dan faktor akurasi.

Lalu bagaimana jika kita ingin menduga pertumbuhan L. monocytogenes pada kondisi yang berbeda, misalnya pada suhu lebih rendah/tinggi atau justru pada bahan pangan atau media yang lain? Bisakah parameter kinetika pertumbuhan yang diperoleh dari media susu yang disimpan pada suhu 7°C digunakan untuk tujuan tersebut? Laju pertumbuhan maksimum yang sebelumnya diperoleh adalah laju pertumbuhan maksimum yang spesifik untuk media susu pada suhu 7°C, sehingga apabila digunakan untuk menduga pertumbuhan pada suhu 4°C, pendugaan yang dihasilkan akan lebih cepat dari seharusnya dan sebaliknya lebih lambat apabila digunakan untuk pendugaan pada suhu yang lebih tinggi.

Untuk menduga pertumbuhan pada kondisi yang berbeda diperlukan pemodelan yang sedikit lebih kompleks, menggunakan tidak hanya model pertumbuhan primer tetapi juga model pertumbuhan sekunder. Berbeda dengan model pertumbuhan primer yang mendeskripsikan jumlah mikroba berdasarkan fungsi waktu, model pertumbuhan sekunder mendeskripsikan hubungan antara parameter kinetika yang diperoleh dari model pertumbuhan primer (dalam hal ini adalah laju pertumbuhan maksimum, μmax) dengan kondisi lingkungan pertumbuhannya, yang dikenal juga sebagai faktor intrinsik dan ekstrinsik.

Sebagaimana diketahui, pertumbuhan mikroba dipengaruhi antara lain oleh faktor intrinsik, seperti pH, aktivitas air (aw), dan kandungan asam organik yang digunakan sebagai pengawet alami, maupun faktor ekstrinsik, seperti suhu atau temperatur. Setiap mikroba memiliki kemampuan tumbuh pada rentang tertentu yang berbeda-beda, misalnya antara pH 4 hingga pH 10. Dalam hal ini, pH 4 disebut sebagai pH pertumbuhan minimal dan pH 10 disebut sebagai pH pertumbuhan maksimal. Secara umum mikroba tidak bisa tumbuh pada pH di bawah pH minimal atau di atas pH maksimal pertumbuhannya. Konsep yang sama juga berlaku untuk faktor intrinsik dan ekstrinsik lainnya. Sebagai contoh dari model pertumbuhan sekunder adalah model sekunder sebagai fungsi pH (Rosso et al., 1995).



Sebagaimana dideskripsikan sebelumnya bahwa model sekunder memanfaatkan hubungan antara parameter kinetika pertumbuhan model primer (μmax) dengan faktor lingkungan yang relevan, penggunaan model sekunder membutuhkan data laju pertumbuhan (μmax) pada berbagai pH, atau temperatur, atau aktivitas air, atau kondisi lain yang relevan dengan kebutuhan. Data μmaxx tersebut dikumpulkan untuk setiap tingkat pH, atau kondisi lingkungan lainnya dan diplotkan berdasarkan fungsi pH, temperatur, aktivitas air, atau kondisi lainnya, untuk memperoleh parameter kinetika, seperti μopt, pHmin, pHopt dan pHmax (Gambar 2). μopt dideskripsikan sebagai laju pertumbuhan pada pH optimum (pHopt), pHmin adalah pH minimum dimana suatu mikroba masih dapat tumbuh, pHopt adalah pH dimana laju pertumbuhan mikroba paling optimal dan pHmax adalah pH maksimum di mana suatu mikroba masih dapat tumbuh di dalam suatu media. Penyesuaian model sekunder dengan data μmax sebagaimana Gambar 2 menghasilkan pendugaan μopt; pHmin; pHopt; dan pHmax sebesar 1,14/jam; 4,25; 6,90; dan 9,09.

Parameter kinetika yang diperoleh dari model sekunder tersebut selanjutnya digunakan untuk menghitung μmax dari kondisi yang kita inginkan, misal sesuai karakteristik susu yaitu pH 6,6, aw 0,993 dan temperatur 4 atau 10°C. Namun, agar dapat digunakan untuk menduga pertumbuhan pada media lain dengan kondisi yang berbeda dari susu, data μmax tersebut dapat diperoleh dari pengujian atau dikumpulkan dari literatur yang menggunakan media laboratorium sebagai media pertumbuhan. Media laboratorium umumnya memiliki nutrisi yang optimal dengan pH antara 7,3 - 7,4 dan kandungan garam sebesar 0,5% (aw 0,997), sehingga dapat digunakan sebagai kondisi referensi.

Karakteristik susu dengan pH 6,6 dan aw 0,993 berbeda dengan karakteristik media laboratorium sebagaimana dideskripsikan sebelumnya. Untuk menduga pertumbuhan L. monocytogenes dalam susu yang disimpan pada suhu 4°C atau 10°C, diperlukan model sekunder lain yang menggabungkan efek dari faktor lingkungan (intrinsik dan ekstrinsik) yang sebelumnya dimodelkan secara terpisah menggunakan model sekunder sebagai fungsi pH, fungsi aw dan fungsi temperatur, sehingga μmax yang diperoleh adalah μmax untuk pH 6,6; μmax untuk aw 0,993 dan μmax untuk suhu 4°C atau 10°C. Padahal untuk menduga pertumbuhan L. monocytogenes pada susu yang disimpan pada suhu tersebut diperlukan μmax total atau μmax gabungan untuk seluruh kondisi yang diinginkan.



Dengan asumsi bahwa efek dari masing-masing kondisi lingkungan tersebut terhadap pertumbuhan mikroba adalah multiplikasi/perkalian, model gamma (Zwietering et al., 1993) (persamaan [4]) dapat digunakan untuk menghitung μmax total, dimana setiap gamma adalah nilai μmax untuk masingmasing kondisi lingkungan, seperti pH, aw, dan temperatur. Nilai gamma atau μmax total selanjutnya akan digunakan sebagai input pada persamaan [5] untuk memperoleh μmaxx pada kondisi pH 6,6; aw 0,993 dan suhu 4°C. Nilai μref pada persamaan tersebut adalah laju pertumbuhan yang diperoleh pada kondisi referensi, yaitu media laboratorium dan suhu 30°C. Nilai μmax yang diperoleh dari persamaan [5] selanjutnya akan digunakan sebagai input pada persamaan [2], yaitu model primer logistik sebagaimana digunakan sebelumnya. Pendugaan dengan menggunakan model sekunder cukup kompleks dan membutuhkan pengetahuan dan/ atau skill tertentu, sehingga beberapa institusi telah membuat model tersier berupa perangkat lunak/software yang dapat dimanfaatkan secara mudah oleh pengguna umum. Perangkat lunak/ software atau model tersier yang sering digunakan untuk pendugaan pertumbuhan mikroba antara lain adalah Pathogen Modelling Program (PMP), Combase, Sym’Previus dan perangkat lunak/software lain yang relevan. Namun demikian, output yang diperoleh dari model tersier tersebut juga perlu divalidasi sebelum digunakan untuk menjamin akurasi dari pendugaan yang dihasilkan. Validasi umumnya dilakukan menggunakan set data yang baru yang tidak digunakan untuk pemodelan sebelumnya. Set data yang baru tersebut dapat dikumpulkan melalui pengujian maupun menggunakan data yang diperoleh dari literatur.



Pendugaan inaktivasi mikroba

Pendugaan inaktivasi mikroba dilakukan dengan menggunakan nilai D dan z. Nilai D adalah waktu yang dibutuhkan untuk mengurangi jumlah atau populasi awal mikroba sebanyak 1 log atau 90%, sedangkan nilai z adalah kenaikan suhu yang diperlukan untuk mengurangi nilai D sebanyak 10 faktor (misal dari 1 menit menjadi 0,1 menit). Nilai D dan z suatu mikroba dapat diperoleh dari literatur atau dapat dikumpulkan secara internal melalui pengujian menggunakan media laboratorium ataupun media pangan sesuai kebutuhan. Data yang dikumpulkan untuk keperluan tersebut adalah jumlah mikroba yang tersisa (Nt) pada waktu t setelah mengalami perlakuan panas atau non panas lainnya. Model yang dapat digunakan meliputi model linier atau non linier, disesuaikan dengan kurva inaktivasi yang diperoleh. Untuk mengakomodasi kurvatur/lengkungan yang sering ditemui pada kurva inaktivasi, beberapa peneliti mengadopsi model Weibull atau modifikasi Weibull (Mafart et al.., 2002) (persamaan [6]), dimana ß adalah parameter bentuk (shape parameter) untuk mengakomodir lengkungan (ß=1 linier, ß<1 cekung, dan ß>1 cembung) dan δ adalah waktu yang diperlukan untuk pengurangan desimal yang pertama.



Untuk mempermudah penggunaan, karena umumnya reduksi yang diinginkan adalah minimal 5 log untuk sel vegetatif dan 12 log untuk spora, modifikasi pada Weibull model juga dilakukan dengan mengintegrasikan nilai log reduksi yang diinginkan pada model tersebut. ΔD pada persamaan [7] (Metselaar, et al., 2013) adalah waktu yang diperlukan untuk mengurangi populasi awal sebanyak Δ log (2, 3, 5, dan seterusnya), sehingga nilai D yang dihasilkan adalah nilai rata-rata yang diperolah dari pembagian antara nilai ΔD dengan Δ. Dari ilustrasi pada Gambar 3, model sesuai persamaan [6] disesuaikan dengan data untuk memperoleh nilai ΔD yaitu 5D dan selanjutnya membagi nilai 5D tersebut dengan Δ, yaitu 5, untuk memperoleh nilai D rata-rata. Nilai D rata-rata tersebut selanjutnya dapat digunakan untuk menduga jumlah sel mikroba yang tersisa (Nt) pada waktu t, jika susu yang mengandung sejumlah sel mikroba tertentu (N0) dipanaskan pada suhu 65°C.

Lalu bagaimana kita menduga jumlah mikroba yang tersisa pada pada suatu waktu tertentu jika suhu yang digunakan lebih rendah atau lebih tinggi dari yang digunakan sebelumnya? Untuk itu kita perlu nilai z, sebagaimana telah disebutkan sebelumnya nilai z adalah kenaikan suhu yang diperlukan untuk mengurangi nilai D sebanyak 10 faktor. Nilai z ini dapat diperoleh dari literatur atau dihitung berdasarkan persamaan hubungan antara log nilai D dan temperatur sebagaimana persamaan [8]. Selanjutnya nilai z yang diperoleh tersebut dapat digunakan dalam model atau persamaan yang sama untuk mendapatkan nilai D pada suhu yang diinginkan, yaitu di bawah atau di atas suhu referensi.





Namun demikian, pendugaan inaktivasi mikroba menghadapi tantangan yang besar karena adanya perbedaan ketahanan atau resistansi yang dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain perbedaan strain dalam dalam satu spesies, riwayat pertumbuhan/kelangsungan hidup, kondisi fisiologis sel, hingga perbedaan matriks atau medium yang digunakan untuk inaktivasi. Untuk mengatasi tantangan tersebut, pendugaan dapat dilakukan dengan menggunakan nilai D terbesar (misal batas atas selang kepercayaan/prediksi). Perbedaan karena pengaruh faktor-faktor ini tidak hanya menjadi tantangan bagi pendugaan, tetapi juga bagi pelaksanaan validasi. Untuk meminimalkan risiko bias, uji tantangan dapat dilakukan dengan menggunakan minimum 5 strain, yang mencakup strain yang memiliki ketahanan yang paling besar terhadap kondisi yang diuji, strain dengan laju pertumbuhan yang cepat, dan strain yang diketahui terlibat dalam kasus keamanan pangan (outbreak).

Referensi:
Mafart, P., Couvert, O., Gaillard, S., Leguerinel, I. 2002. On calculating sterility in thermal preservation methods: application of the Weibull frequency distribution model. International Journal of Food Microbiology 72, 107 – 113.

Metselaar, K.I., Den Besten, H.M.W., Abee, T., Moezelaar, R., Zwietering, M.H. 2013. Isolation and quantification of highly acid resistant variants of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology 166, 508 – 514.

Rosso, L., Lobry, J.R., Bajard, S., Flandrois, J.P. 1995. Convenient model to describe the combined effect of temperature and pH on microbial growth. Applied and Environmental Microbiology 61, 610 – 616.

Rosso, L., Bajard, S., Flandrois, J.P., Lahellec, C., Fournaud, J., Veit, P. 1996. Differential growth of Listeria monocytogenes at 4 and 8°C: consequences for the shelf life of chilled products. Journal of Food Protection 59 (9), 944 – 949.

Zwietering, M.H., Wijtzes, T., Rombouts, F.M., Van ‘t Riet, K. 1993. A decision support system for prediction of microbial spoilage in foods. Journal of Industrial Microbiology 12, 324 – 329.